市场论述（1 / 1）

除了上述因素外，PH温度，光照等条件也很重要。不同的植物对各种条件的要求往往不同，进行菊花的组织培养，一般将在PH控制在5~8左右，温度控制在18~22度，并且每日用日光灯照射12H。

实验操作，一制备MS固体培养基，MS培养基含有20多种营养成分，实验室一般使用4度保存的配制好的培养基液来制备，具体操作如下：一配备各种母液，配制母液时，无机物中大元量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍（MS培养基的配方参见附录图3），常温保存。激素类，维生素类以及用量较小的有机物一般可按1MLGL的质量浓度单独配制成母液，用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量。

二配制培养基，配制1MS培养基时，先将称好的琼脂加入800ML蒸馏水，加热使琼脂熔化，然后加入蔗糖30G，取配制好的大量元素，微量元素，有机物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容至1000ML，调节HP，最后分装到锥形瓶中，每瓶分装50ML或100ML，由于菊花茎段的组织培养比较容易。因此，不必添加植物激素。如果有兴趣，你也可以试着添加一些激素。

三灭菌，将分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌。首先选取菊花茎段时，要取生长旺盛的嫩枝，菊花茎段用水冲冼后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在水流下冲洗20MIN左右。用无菌吸水低吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70%的酒精中摇动2~3次，持续6~7S，立即将外植体取出，在无菌水中清洗。取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为0。1%的氯化汞溶液中1~2MYN。取出后，在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液。

接种，接种前用体积分数为70%的酒精将工作台擦拭一遍，工作台消毒后，首先点燃酒精灯。此后，所有的接种操作都必须在酒精灯旁进行，并且每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌。将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段（长约0。5~1CM）。左手持锥形瓶，右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥于右手手心，以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰：右手用镊子夹取菊花茎段，插入培养基中（图3~3）插入时应注意方向，不要倒插。每瓶接种6~8块外植体，接种后，将封口膜重新扎好。

培养，接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒。培养温度控控制在18~22度，并且每日用日光灯光照12H。

移栽，在移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培培养间生长几天。然后用水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间，等幼长壮后再移栽到土壤中（图3~4）。

栽培，将幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗生长情况（图3~4），适时浇水，施肥，直至开花。但是管理很重要，接种3~4天后，观察外植体的生长情况，统计有多少外植体被污染，有多少能正常生长。分析外植体被污染的原因。

比如说你培养出愈伤组织了吗？从接种到长出愈伤组织经历了多少天？你培养出愈伤组织进一步分化出根和芽了吗？两周后观察茎段的分化情况，填好结果记录表，并及时分析结果。幼苗移栽到露地后，能够正常生长吗？一般来说，容易进行无性繁殖的植物，也容易进行组织培养，如芦荟，豆辩绿，秋海棠，月季等。你可以从挑选一种你喜欢的植物，进行组织培养。

如果你对植物激素的作用感兴趣的话，可以在查阅资料的基础上，探究生长素与细胞分裂素的使用比例对植物组织培养的影响。例如，你可以设计一组对照实验，分别探究不加任何植物激素，生长素用量与细胞分裂素用量的比值为1，比值大于1以及比值小于1时，对实验结果的影响。

接着给同学们说月季的花药培养，还是先说课题背景，1964年，印度科学家在培养毛叶曼陀罗的花药时。首次获得了由花药中的花粉粒发育而来的单倍体植株。这个实验说明殖细胞和体细胞一样，在离体条件下也具有发育成完整植株的潜能。自20世纪60年代以来，花药培养的研究发展迅速。据记载，世界上已有250多种高等植物的花药培养获得成功，其中小麦，玉米，大豆，甘蔗和橡胶等近50种植物的花粉再生植株已由我国科技人员首先培育成功。植物的花药培养在育种上有特殊的意义。育种工作者可以采用花药培养的方法，使花粉粒发育为单倍体植株，再经过人工诱导使染色体数目加倍。重新恢复到正常植株的染色体数目。这样的植株不仅能够正常生殖，而且每对染色体上的成对的基因都是纯合的。自交生产的后代不会产生性状分离。单倍体育种不仅缩短了育种周期，也为新品种的培育开辟了新途径。在体课题中，我们将尝试月季的花药培养。

一被子植物的花粉发育，被子植物的雄蕊通常包含花丝，花药两部分。花药为囊状结构，内部含有许多花粉，花粉是由花母细胞经过减数分裂而成形的。因此，花粉是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体期时期，4个单倍体细胞连在一起，进入单核期时，四分体的四个单倍体细胞彼此分离。形成4个具有单细胞核的花粉粒。这时的细胞含浓厚的原生质，核位于细胞的中央（单核靠边期），并分裂成1个生殖细胞的中央移向细胞核，进而形成两个细胞，一个是生殖细胞，一个是营养细胞。生殖细胞将再分裂一次，形成两个精子。

二产生花粉植株的两种途径，通过花药培养产生花粉植株（即单体植株）一般有两种途径（图3~7），一种是花粉通过胚状体段发育为植株，另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决培养基中激素的种类及其浓度配比。

人们一直以为，植物细胞的离体培养只能通过分别诱导芽和根等器官再发育成植株，20世纪50年代未，科学家在胡萝卜根组织的单细胞悬浮培养液中发现，某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，它的发育过程也与合子胚类似，胚芽，胚根，胚轴等结构完整，就像一颗种子。科学家将这种结构称做体细胞胚（SOMATICEMBRYO）或胚状体（EMBYOID）。除了植物的体细胞外，由单倍体细胞产生的花粉胚，也可发育成为单倍体植株。

影响花药培养的因素，诱导花粉植株能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中，材料的选择与培养基的组成是主要的影响因素。

不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来说，亲体植株的生理状况对诱导成功率也有直接影响。花期早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株。一般月季花的花药培养时间选在五月初到五月中旬，即月季的初花期。选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成功率的重要因素。这是因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，在花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体剌激敏感。一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期。花药培培养成功率最高。选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎：选择单核期以后的花药接种，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难。为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾（图3~8）。盛开的或略微开放的花（图3~9），都不宜先作实验材料。此外，亲本植株生长条件，材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定的影响。

材料的选取，选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期，确定花粉发育时期的最常用的方法有醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不容易着色，需采用焙花青—铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色。醋酸洋红法，将花药放在载玻片上，加一滴质量分数为1%的醋酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片后在显微镜下检查。醋酸洋红的配制方法是：将体积分数为45%的醋酸100ML煮沸，缓缓地加入1G洋红，再加热回流（回流装置参见专题课2）8H，冷却至50度，过滤即可。

焙花青—铬矾法，花药应先在卡诺氏固定液中固定20MYN，然后取出放在载玻片上，加焙花青—铬矾溶液染色，盖上盖玻片后在显微镜一检查。卡诺氏固定液的配制方法是：将无水酒精与冰醋酸按体积比例为3：1的比成混匀。焙花青——铬矾溶液的配制方法是：将5G铬钾矾{K2SO4CR2（SO4）。24H2O}加入90ML蒸馏水中，溶解后加入0。1G焙花青，混匀并加热至沸腾，煮沸5MYN后冷却至室温，过滤，加蒸馏水定容至100ML。

材料的消毒，通常先将花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡大约30S，立即取出，在无菌水中清洗。取出后再用无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分，放入质量分数为0。1%的氯化汞溶液中2~4MIN（也可以用质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂淀粉溶液）取出后再用无菌水冲洗3~5次。

接种和培养，灭菌后的花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部分产生愈伤组织），同时，还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。

通常每瓶接种花药7`10个，培养温度控制在25度左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。一般经过20~30天D培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或形成胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。

在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植树株，染色体组织数目常常会发生变化。因此还需要对培养出来的植株作进一步的签定和筛选选。今天就讲到这里，下课。”于是陈跃进就拿起教案往教室门外走出去。

可是同学们听到下课了，都开心了，一时间，教室将是熙熙攘攘，调皮的男生就互相扯皮捣蛋，女生就带着微笑，往教室门外走出去方便。于是，走廊里，洗手间，到处都是男生跟女生的身影，是来也匆匆去冲冲。

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